細胞的基因轉染
1.基因轉染技術原理：
將特定的遺傳信息傳遞到真核細胞中，這種能力不但革新了生物學和醫學中許多基本問題的研究，也推動了診斷和治療方面的分子技術發展，并使基因治療成為可能。目前基因轉移技術已廣泛用于基因的結構和功能分析、基因表達與調控、基因治療與轉基因動物等研究。
2.基因轉移的病毒的方法
作為基因轉移的遞送工具，病毒載體的優點有：（1）在轉化的細胞中傳播重組的DNA分子作為穩定的遺傳成分；（2）可將有制陷的或突變的基因置于病毒調節信號的控制下以進行研究；（3）能將克隆的基因作為病毒微染色體的一部分 ，并能進行分離；（4）轉移效率較高。其主要缺點是病毒載體對外源基因容納量不夠。目前常用的病毒載體有下列幾種：
逆轉錄病毒載體 逆轉錄病毒為RNA病毒，它們的基因組編碼在一條單鏈RNA上，病毒進入細胞通過逆轉錄作用，病毒RNA即轉變為雙鏈DNA分子，DNA進入細胞核并整合在細胞染色體中，這種整合的病毒稱為原病毒。在原病毒的兩端各有一長末端重復序列（LTR）,LTR內側還有為復制所必需的其他順序，包括包裝信號。目前常用的逆轉病毒載體有CMV和SV。
DNA病毒載體 主要有腺病毒相關病毒載體，腺端正毒載體，皰疹病毒載體。對DNA病毒載體的研究是當前基因治療研究中的重點領域。
3.常用的基因轉染技術
將外源基因導入靶細胞需要一定的載體和導入方法，基因轉技術則是將純化的含有靶基因的質粒DNA送入細胞內，并在細胞內表達。轉染方法有多種，根據不同的細胞，貼壁或懸浮細所可選用不同的方法，其目的是要達到設置轉染效率，影響轉染產率的因素有多種，包括轉染方法、操作技術、質粒DNA的純度、靶細胞的生長狀態等，下面重點介紹向幾種常用的轉染技術：
靶細胞的準備 被用于作靶基因轉染的細胞，其生長狀態如何，將直接決定了基因轉染效率。如為貼壁生長的細胞，一般要求在轉染前一日，必需應用胰酶處理成單細胞懸液，重新接種于培養皿或瓶，細胞密度以鋪滿培養器皿的60%為宜，轉染當日，在轉染前4小時換一次新鮮培養液。對于懸浮細胞，也需在轉染前4小時換一次新鮮培養液。
靶基因質粒DNA的準備 用于轉染的質粒DNA必須無蛋白質，無RNA和其化學物質的污染，OD260/280比值應在1.8以上。應用酚-氯仿抽提法制備的質粒DNA一般難以達到此標準，目前大多采用提取純化試劑盒。
具體的基因轉染技術有鱗酸鈣介導的轉染法、DEAE葡聚糖介導轉染法、脂質體介導轉染法及電擊基因轉導塵等。靶基因被導入細胞后，一般在轉染后48小時，靶基因即在細胞內表達。根據不同的實驗目的，48小時后即可進行靶基因表達的檢測等實驗。如若建立穩定的細胞系，則可對靶細胞進行篩選，根據不同基因載體中所含有的抗性標志選用相應的藥物，最常用的直核表達基因載體的標志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。
將特定的遺傳信息傳遞到真核細胞中，這種能力不但革新了生物學和醫學中許多基本問題的研究，也推動了診斷和治療方面的分子技術發展，并使基因治療成為可能。目前基因轉移技術已廣泛用于基因的結構和功能分析、基因表達與調控、基因治療與轉基因動物等研究。
2.基因轉移的病毒的方法
作為基因轉移的遞送工具，病毒載體的優點有：（1）在轉化的細胞中傳播重組的DNA分子作為穩定的遺傳成分；（2）可將有制陷的或突變的基因置于病毒調節信號的控制下以進行研究；（3）能將克隆的基因作為病毒微染色體的一部分 ，并能進行分離；（4）轉移效率較高。其主要缺點是病毒載體對外源基因容納量不夠。目前常用的病毒載體有下列幾種：
逆轉錄病毒載體 逆轉錄病毒為RNA病毒，它們的基因組編碼在一條單鏈RNA上，病毒進入細胞通過逆轉錄作用，病毒RNA即轉變為雙鏈DNA分子，DNA進入細胞核并整合在細胞染色體中，這種整合的病毒稱為原病毒。在原病毒的兩端各有一長末端重復序列（LTR）,LTR內側還有為復制所必需的其他順序，包括包裝信號。目前常用的逆轉病毒載體有CMV和SV。
DNA病毒載體 主要有腺病毒相關病毒載體，腺端正毒載體，皰疹病毒載體。對DNA病毒載體的研究是當前基因治療研究中的重點領域。
3.常用的基因轉染技術
將外源基因導入靶細胞需要一定的載體和導入方法，基因轉技術則是將純化的含有靶基因的質粒DNA送入細胞內，并在細胞內表達。轉染方法有多種，根據不同的細胞，貼壁或懸浮細所可選用不同的方法，其目的是要達到設置轉染效率，影響轉染產率的因素有多種，包括轉染方法、操作技術、質粒DNA的純度、靶細胞的生長狀態等，下面重點介紹向幾種常用的轉染技術：
靶細胞的準備 被用于作靶基因轉染的細胞，其生長狀態如何，將直接決定了基因轉染效率。如為貼壁生長的細胞，一般要求在轉染前一日，必需應用胰酶處理成單細胞懸液，重新接種于培養皿或瓶，細胞密度以鋪滿培養器皿的60%為宜，轉染當日，在轉染前4小時換一次新鮮培養液。對于懸浮細胞，也需在轉染前4小時換一次新鮮培養液。
靶基因質粒DNA的準備 用于轉染的質粒DNA必須無蛋白質，無RNA和其化學物質的污染，OD260/280比值應在1.8以上。應用酚-氯仿抽提法制備的質粒DNA一般難以達到此標準，目前大多采用提取純化試劑盒。
具體的基因轉染技術有鱗酸鈣介導的轉染法、DEAE葡聚糖介導轉染法、脂質體介導轉染法及電擊基因轉導塵等。靶基因被導入細胞后，一般在轉染后48小時，靶基因即在細胞內表達。根據不同的實驗目的，48小時后即可進行靶基因表達的檢測等實驗。如若建立穩定的細胞系，則可對靶細胞進行篩選，根據不同基因載體中所含有的抗性標志選用相應的藥物，最常用的直核表達基因載體的標志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。
- 上一篇：血液運輸管道——血管的生理機制 2020/5/27
- 下一篇：基因突變的檢測方法 2020/5/27
