生物菌種凍干保存步驟
2020/11/10 16:17:34
生物菌種凍干保存步驟
詳細介紹
凍干機適用于大多數細菌、放線菌、病毒、噬菌體、立克次體、霉菌和酵母等的真空冷凍干燥保藏，但不適于霉菌的菌絲型、菇類、藻類和原蟲等。生物菌種凍干保存步驟，其操作流程如下：
1、安瓿管準備
安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時，先用2%鹽酸浸泡過夜，自來水沖洗干凈后，用蒸餾水浸泡至pH中性，干燥后、貼上標簽，標上菌號及時間，加入脫脂棉塞后，121℃下高壓滅菌15-20分鐘，備用。
2、保護劑的選擇和準備
保護劑種類要根據微生物類別選擇。配制保護劑時，應注意其濃度及pH值，以及滅菌方法。如血清，可用過濾滅菌；牛奶要先脫脂，用離心方法去除上層油脂，一般在100℃間歇煮沸2-3次，每次10-30分鐘，備用。
3、凍干樣品的準備
在適宜的培養條件下將細胞培養至靜止期或成熟期，進行純度檢查后(參見科技部自然科技資源平臺聯合管理辦公室文件《微生物菌種純度檢測技術規程》(試行))，與保護劑混合均勻，分裝。微生物培養物濃度以細胞或孢子不少于108-1010個/ml為宜(以大腸桿菌為例，為了取得每毫升1010個活細胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升瓊脂斜面兩支)。采用較長的毛細滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要濺污上部管壁，每管分裝量約0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，裝量為半個球部。若是液體培養的微生物，應離心去除培養基，然后將培養物與保護劑混勻，再分裝于安瓿管中。分裝安瓿管時間盡量要短，在1-2小時內分裝完畢并預凍。分裝時應注意在無菌條件下操作。
4、預凍
一般預凍2小時以上，溫度達到-20℃到-35℃左右。
5、冷凍干燥
采用凍干機進行冷凍干燥。將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機的干燥箱內，開始冷凍干燥，時間一般為8-20小時。
終止干燥時間應根據下列情況判斷：
安瓿管內凍干物呈酥塊狀或松散片狀；
真空度接近空載時的zui高值；
樣品溫度與管外溫度接近；
選用1-2支對照管，其水份與菌懸液同量，視為干燥完結；
選用一個安瓿管，裝1-2%氯-化鈷，如變深蘭色，可視為干燥完結；
冷凍干燥完畢后，取出樣品安瓿管置于干燥器內，備用。
6、真空封口及真空檢驗
將安瓿管頸部用強火焰拉細，然后采用真空泵抽真空，在真空條件下將安瓿管頸部加熱熔封。熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測定儀測定真空度。
7、保藏
安瓿管應低溫避光保藏。
8、質量檢查
冷凍干燥后抽取若干支安瓿管進行各項指標檢查，如存活率、生產能力、形態變異、雜菌污染等。
1、安瓿管準備
安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時，先用2%鹽酸浸泡過夜，自來水沖洗干凈后，用蒸餾水浸泡至pH中性，干燥后、貼上標簽，標上菌號及時間，加入脫脂棉塞后，121℃下高壓滅菌15-20分鐘，備用。
2、保護劑的選擇和準備
保護劑種類要根據微生物類別選擇。配制保護劑時，應注意其濃度及pH值，以及滅菌方法。如血清，可用過濾滅菌；牛奶要先脫脂，用離心方法去除上層油脂，一般在100℃間歇煮沸2-3次，每次10-30分鐘，備用。
3、凍干樣品的準備
在適宜的培養條件下將細胞培養至靜止期或成熟期，進行純度檢查后(參見科技部自然科技資源平臺聯合管理辦公室文件《微生物菌種純度檢測技術規程》(試行))，與保護劑混合均勻，分裝。微生物培養物濃度以細胞或孢子不少于108-1010個/ml為宜(以大腸桿菌為例，為了取得每毫升1010個活細胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升瓊脂斜面兩支)。采用較長的毛細滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要濺污上部管壁，每管分裝量約0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，裝量為半個球部。若是液體培養的微生物，應離心去除培養基，然后將培養物與保護劑混勻，再分裝于安瓿管中。分裝安瓿管時間盡量要短，在1-2小時內分裝完畢并預凍。分裝時應注意在無菌條件下操作。
4、預凍
一般預凍2小時以上，溫度達到-20℃到-35℃左右。
5、冷凍干燥
采用凍干機進行冷凍干燥。將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機的干燥箱內，開始冷凍干燥，時間一般為8-20小時。
終止干燥時間應根據下列情況判斷：
安瓿管內凍干物呈酥塊狀或松散片狀；
真空度接近空載時的zui高值；
樣品溫度與管外溫度接近；
選用1-2支對照管，其水份與菌懸液同量，視為干燥完結；
選用一個安瓿管，裝1-2%氯-化鈷，如變深蘭色，可視為干燥完結；
冷凍干燥完畢后，取出樣品安瓿管置于干燥器內，備用。
6、真空封口及真空檢驗
將安瓿管頸部用強火焰拉細，然后采用真空泵抽真空，在真空條件下將安瓿管頸部加熱熔封。熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測定儀測定真空度。
7、保藏
安瓿管應低溫避光保藏。
8、質量檢查
冷凍干燥后抽取若干支安瓿管進行各項指標檢查，如存活率、生產能力、形態變異、雜菌污染等。
